徕卡激光共聚焦显微镜(如Leica SP8、Stellaris系列)是一种高分辨率三维成像系统，广泛应用于生物医学、材料科学等领域。其操作需结合光学、激光控制和图像处理技术，以下是详细操作指南：
 

　　一、操作前准备
 

　　1. 环境与设备检查
 

　　环境要求：
 

　　独立暗室或遮光环境，避免外界光线干扰荧光信号。
 

　　温度控制在20-25℃，湿度≤60%，防止镜头结露或电路故障。
 

　　设备检查：
 

　　确认激光器(如405nm、488nm、561nm、633nm)状态指示灯正常(绿色为就绪)。
 

　　检查物镜(如10x/0.3、20x/0.75、63x/1.4油镜)是否清洁，载物台移动是否顺畅。
 

　　开启冷却系统(如激光器水冷机)，确保温度稳定在设定值(通常18-22℃)。
 

　　2. 样品准备
 

　　生物样品：
 

　　活细胞需培养在共聚焦专用培养皿(如Lab-Tek II)中，避免使用普通玻片导致聚焦困难。
 

　　固定组织切片需用抗荧光淬灭封片剂(如ProLong Gold)封片，厚度≤20μm。
 

　　材料样品：
 

　　非透明样品需抛光至表面粗糙度Ra<0.1μm，透明样品(如聚合物)需避免自发荧光干扰。
 

　　标记要求：
 

　　荧光染料需与激光波长匹配(如DAPI用405nm激发，Alexa Fluor 488用488nm激发)。
 

　　多色标记时，确保染料发射光谱无重叠(可通过光谱拆分功能分离信号)。
 

　　二、基础操作流程
 

　　1. 开机与初始化
 

　　启动顺序：
 

　　打开总电源 → 2. 启动激光器冷却系统 → 3. 开启显微镜主机 → 4. 启动控制软件(如LAS X或Stellaris Suite)。
 

　　软件自检：
 

　　软件自动检测激光器、扫描头、载物台等模块，确认状态为“Ready”。
 

　　运行“Daily Check”功能，校准光路和检测系统灵敏度(如PMT增益、激光功率)。
 

　　2. 样品定位与对焦
 

　　低倍镜预览：
 

　　选择10x空气镜，关闭激光，使用透射光(如卤素灯)快速定位样品区域。
 

　　通过载物台XY旋钮或软件导航功能移动至目标位置。
 

　　共聚焦对焦：
 

　　开启488nm激光(低功率，如5%)，选择“Live”模式实时观察。
 

　　调节Z轴步进电机，使用“Fine Focus”工具逐步聚焦，直至荧光信号强。
 

　　切换至高倍物镜(如63x油镜)时，需在物镜与盖玻片间滴加专用浸油(如Type F油)。
 

　　3. 图像采集参数设置
 

　　激光功率与PMT增益：
 

　　激光功率：从1%开始逐步增加，避免光漂白(通常不超过20%)。
 

　　PMT增益：调整至信号强度在100-800(12bit图像)之间，避免饱和(>4095)。
 

　　扫描参数：
 

　　分辨率：根据需求选择512×512(快速预览)或2048×2048(高精度成像)。
 

　　扫描速度：线平均次数1-4次(噪声大时增加)，帧平均次数1-8次(活细胞动态成像时减少)。
 

　　针孔大小：通常设为1 Airy单位(AU)，平衡分辨率与信噪比。
 

　　光谱设置：
 

　　多色标记时，在“Lambda Scan”模式下扫描样品发射光谱，设置波长范围(如DAPI: 410-480nm, Alexa Fluor 488: 500-550nm)。
 

　　4. 三维成像与时间序列
 

　　Z轴堆叠：
 

　　设置起始/结束位置和步长(如0.5μm)，软件自动拍摄多层图像并合成3D模型。
 

　　时间序列：
 

　　活细胞成像时，设置时间间隔(如每30秒1帧)和总帧数(如100帧)，记录动态过程。
 

　　启用“Autofocus”功能保持焦点稳定，避免细胞移动导致离焦。

 

　　三、徕卡激光共聚焦显微镜功能应用
 

　　1. 光片照明模式(Light Sheet)
 

　　适用于厚样品(如斑马鱼胚胎)的快速低光毒性成像。
 

　　操作步骤：
 

　　切换至光片模块，调整照明光片厚度(通常2-5μm)。
 

　　设置双摄像头同步采集(如透射光与荧光信号)。
 

　　通过“Multi-View”功能拼接多角度图像，重建三维结构。
 

　　2. 超分辨率成像(如STED)
 

　　突破衍射极限，分辨率达20-50nm。
 

　　操作要点：
 

　　使用专用STED物镜(如100x/1.4油镜)和 depletion激光(如592nm)。
 

　　调整depletion激光功率(通常50-200mW)和相位掩模模式(如2D或3D STED)。
 

　　采集后使用“Huygens”或“Thunder”软件进行反卷积处理。
 

　　3. 光谱拆分与线性去卷积
 

　　多色标记时分离重叠信号：
 

　　在“Lambda Scan”模式下获取样品发射光谱库。
 

　　在“Spectral Unmixing”工具中加载光谱数据，软件自动计算各通道纯信号。
 

　　调整阈值去除背景噪声，保存拆分后的图像。
 

　　四、维护与保养
 

　　1. 日常清洁
 

　　光学元件：
 

　　用吹气球清除物镜、滤光片表面灰尘，禁用棉签或纸巾直接擦拭。
 

　　若需清洁，用镜头纸蘸取少量乙醇(或专用清洁液)，以螺旋方式轻擦。
 

　　载物台与样品仓：
 

　　用防静电布擦拭，避免残留浸油或封片剂。
 

　　2. 激光器维护
 

　　使用限制：
 

　　连续工作不超过8小时，避免激光管过热损坏。
 

　　关机时先降低激光功率至1%，再关闭激光器开关。
 

　　寿命监测：
 

　　在软件“Laser Status”界面查看剩余寿命(如488nm激光通常≥20,000小时)。
 

　　接近寿命终点时，提前联系徕卡更换激光管。
 

　　3. 定期校准
 

　　光路校准：
 

　　每季度使用标准荧光微球(如TetraSpeck)校准光轴和针孔对齐。
 

　　机械校准：
 

　　每年检查载物台XY/Z轴精度(误差应<0.1μm)，必要时调整步进电机参数。
 

　　五、常见问题解决
 

　　图像无信号
 

　　检查激光是否开启、PMT增益是否>0、滤光片是否匹配(如发射滤光片未阻挡信号)。
 

　　图像模糊
 

　　确认物镜浸油是否充足、针孔是否偏移、样品是否平整(如活细胞突起导致离焦)。
 

　　激光功率不稳定
 

　　清洁激光器出口窗口，检查冷却系统水温是否在设定范围(如±0.5℃)。
 

　　软件卡顿
 

　　关闭其他大型程序，降低图像分辨率或扫描速度，或增加计算机内存(建议≥32GB)。
 

　　六、徕卡激光共聚焦显微镜安全注意事项
 

　　激光安全：
 

　　操作时佩戴激光防护眼镜(波长需覆盖所有使用激光线)。
 

　　禁止直视激光束或反射光，避免皮肤长时间暴露于高功率激光(如>50mW)。
 

　　生物安全：
 

　　处理活细胞或病原体时，在生物安全柜内操作，防止样本污染。
 

　　化学安全：
 

　　使用有机溶剂(如乙醇)清洁时，在通风橱内操作，避免吸入挥发气体。